Strutture cristalline della beta polimerasi umana complessate con DNA rotto e intaccato: evidenza di un meccanismo di allineamento indotto.

• La DNA beta (pol beta) polimerasi riempie le lacune in un singolo nucleotide (nt) nel DNA prodotto dalla via di riparazione mediante escissione di basi nelle cellule di mammifero.
• Sono state determinate le strutture cristalline che rappresentano gli intermedi nella reazione di riempimento del gap beta di 1 nt pol: complesso binario con un substrato di DNA rotto (risoluzione 2,4 A), complesso ternario contenente   ddCTP   (2,2 A) e complesso di prodotto binario contenente solo DNA intaccato (2,6 A).
• Dopo il legame   di ddCTP   al complesso di gap binario, il sottodominio thumb ruota nella sua conformazione chiusa per contattare la coppia di basi del modello ddCTP altrimenti esposta al   solvente  .
• Il movimento del pollice innesca ulteriori cambiamenti conformazionali che introducono la parte catalitica Asp192, i dNTP e il modello di trasferimento nucleotidico, assemblando con successo il sito attivo.
• In un prodotto con un complesso di DNA tagliato, il pollice ritorna alla sua conformazione aperta, come in un complesso di DNA a due componenti con gap, facilitando la dissociazione del prodotto.
• Questi risultati suggeriscono che pol beta può aumentare la fedeltà attraverso un meccanismo di allineamento indotto in cui un corretto accoppiamento di basi tra il modello e il dNTP in entrata induce l’accoppiamento catalitico del gruppo per la catalisi (tramite la chiusura del pollice), ma l’accoppiamento di basi errato non lo fa.
• Le strutture rivelano anche che la polbeta lega sia il DNA strappato che quello strappato con una curva di 90 gradi esattamente al legame 5′-fosfodiestere del residuo del modello.
• Se il DNA non fosse piegato in questo modo, il contatto tra il pollice e la coppia di basi del dNTP-template, forse importante per il meccanismo di controllo, sarebbe impossibile  , specialmente quando il gap è solo un singolo nucleotide. Un tale attorcigliamento di 90 gradi può essere una caratteristica meccanicistica utilizzata da qualsiasi polimerasi coinvolta nel riempire completamente gli spazi vuoti.

Strutture dei complessi ternari della DNA polimerasi beta di ratto, DNA template primer e   ddCTP  .

I due complessi ternari di DNA polimerasi beta di ratto (pol beta), primer DNA stampo e dideossicitidina trifosfato (  ddCTP  ) sono stati determinati con una risoluzione rispettivamente di 2,9 A e 3,6 A.  DdCTP   è dideossicitidina trifosfato (ddC), un analogo nucleosidico che prende di mira trascrittasi inversa del virus dell’immunodeficienza umana (HIV) ed è attualmente utilizzato nel trattamento dell’AIDS.

Sebbene  i cristalli di entrambi i complessi appartengano a gruppi spaziali diversi, le loro strutture sono simili, suggerendo che le  interazioni polimerasi-DNA-ddCTP  non sono influenzate dalla forza di impaccamento dei cristalli. Nel sito attivo pol beta, il primer di estensione 3′-OH attaccante,  i fosfati ddCTP   e due ioni Mg2 + sono concentrati attorno ad Asp190, Asp192 e Asp256.

Due di questi residui, Asp190 e Asp256, sono presenti nelle sequenze amminoacidiche di tutte le polimerasi studiate fino ad oggi e sono anche spazialmente simili in quattro polimerasi: il frammento di Klenow della DNA polimerasi I di Escherichia coli, la trascrittasi inversa dell’HIV-1, l’RNA T7 polimerasi e DNA di ratto pol beta – le cui strutture cristalline sono attualmente note. Viene descritto il meccanismo della reazione di trasferimento di doppio nucleotide metallico e può essere applicabile a tutte le polimerasi. Nelle strutture complesse ternarie analizzate, pol beta si lega allo stampo del primer del DNA in un modo diverso rispetto a quanto recentemente proposto per altri modelli di DNA polimerasi.

Meccanismo fenotipico della resistenza dell’HIV-1 alla 3′-azido-3′-deossitimidina (AZT): aumento della processività di polimerizzazione e maggiore sensibilità al pirofosfato della trascrittasi inversa virale mutante.

1. Mutazioni multiple associate ad alti livelli di resistenza all’AZT (D67N, K70R, T215F, K219Q) si verificano in due sottodomini separati della trascrittasi inversa virale (RT), suggerendo che queste mutazioni possono contribuire in modo diverso alla resistenza complessiva.
2. Abbiamo confrontato gli RT di tipo selvaggio con gli enzimi mutanti D67N / K70R / T215F / K219Q, D67N / K70R e T215F / K219Q. Il mutante D67N / K70R / T215F / K219Q ha mostrato una maggiore processività della DNA polimerasi; ciò era dovuto alla ridotta dissociazione template/primer da RT ed era dovuto alle mutazioni T215F/K219Q. Il mutante D67N / K70R / T215F / K219Q era meno sensibile all’AZTTP (IC50 circa 300 nM) rispetto a RT in peso (IC50 circa 100 nM) in presenza di pirofosfato 0,5 mM.
3. Questo cambiamento mediato dal pirofosfato nella sensibilità dell’enzima mutante era selettivo per AZTTP poiché valori Km simili per TTP e  inibizione da   parte di ddCTP   e ddGTP sono stati riportati per peso e RT mutante in assenza o presenza di pirofosfato. Il mutante D67N / K70R / T215F / K219Q ha mostrato un aumento del tasso di pirofosforolisi (reazione di sintesi del DNA inversa) del DNA terminato a catena; questo aumento della pirofosforolisi era dovuto alle mutazioni D67N / K70R.
4. Tuttavia, la processività della pirofosforolisi era simile per gli enzimi wild-type e mutanti. Proponiamo che la resistenza dell’HIV-1 all’AZT sia dovuta alla riduzione selettiva  del legame dell’AZTTP e all’aumento della scissione del DNA virale pirofosforolitico con terminazione a catena da parte di RT mutante a livelli fisiologici di pirofosfato, con conseguente riduzione netta della terminazione della catena.
5. L’aumento della processività nella sintesi del DNA virale può essere importante per consentire una facile replicazione dell’HIV in presenza di AZT compensando l’aumento della velocità della reazione inversa.

La beta DNA polimerasi esegue una fase di riempimento del gap di riparazione mediante l’asportazione delle basi iniziate dall’uracile nell’estratto nucleare bovino.

La mancata corrispondenza G: U nel DNA genomico è principalmente dovuta alla deaminazione dei residui di citosina ed è riparata dalla via di riparazione dell’escissione della base. Abbiamo scoperto che l’estratto nucleare di testicolo bovino grezzo esegue la riparazione dell’escissione della base avviata dall’uracile in vitro.

È stato utilizzato un substrato di DNA sintetico da 51 bp, contenente una singola  mancata corrispondenza G: U e l’inclusione di dCMP durante la riparazione era intesa esclusivamente per sostituire l’uracile. Un anticorpo policlonale neutralizzante contro la beta-DNA polimerasi (beta-pol) ha inibito la risposta di riparazione. ddCTP   ha anche inibito la risposta di riparazione, mentre l’afidicolina non ha avuto effetti significativi, suggerendo che era necessaria l’attività del campo beta. Il sistema di riparazione dell’escissione della base è stato quindi ricreato utilizzando componenti parzialmente puliti.

Molte delle attività enzimatiche richieste sono state risolte in modo tale che le attività della DNA ligasi e le attività delle attività di uracile-DNA glicosilasi / apurina / apirimidina endonucleasi sono state separate dalla DNA polimerasi richiesta.