complesso covalente tra la proteina 80.000 Daltons terminale dell’adenovirus e 5′-dCMP in vitro.

I requisiti per Ad DNA prot in questa reazione erano simili a quelli per la replicazione del DNA in vitro. Quando dATP, dTTP  e ddGTP 2 ′, 3′-dideossinucleoside trifosfato (ddNTP) sono stati incorporati nella miscela di reazione, è stato rilevato un complesso allungato che consisteva in una proteina di 80.000 dalton legata a un oligonucleotide a 26 basi.

La formazione di un prodotto esteso, ma non del complesso proteina-dCMP, è stata inibita da   ddATP  , ddCTP o ddTTP. I requisiti per la formazione del complesso proteina-dCMP, la  natura del legame tra la proteina e il dCMP, la dimensione della proteina e l’esistenza delle forme allungate indicavano che la proteina legata  al complesso era identica alla proteina terminale Ad di 80.000 dalton trovato sulla replicazione di molecole di DNA come descritto in Challberg et al. [Chalberg, MD, Desiderio, SV & Kelly, TJ, Jr. (1980) Proc. Natl. Accad. Scienza. USA 77, 5105-5109].

Fosforilazione differenziale di azidotimidina, dideossicitidina e dideossiinosina nelle cellule mononucleate del sangue periferico a riposo e attivate.

L’attività antivirale di azidotimidina (AZT), dideossicitidina (ddC) e dideossiinosina (ddI) contro l’HIV-1 è stata confrontata in PBM stimolato con PHA.

La concentrazione media del farmaco che produceva il 50% di colture negative per p24 Gag era sostanzialmente diversa: 0,06, 0,2 e 6 microM rispettivamente per AZT, ddC e ddI. Abbiamo scoperto che l’AZT era preferenzialmente fosforilato nella forma trifosfato (TP) in PHA-PBM piuttosto che in PBM a riposo non stimolato (R-PBM), producendo un rapporto AZTTP / dTTP da 10 a 17 volte superiore in PHA-PBM rispetto a R – PBM .

La fosforilazione di ddC e ddI nelle loro forme TP, tuttavia, era significativamente meno efficiente in PHA-PBM, risultando in rapporti ddCTP / dCTP e ddATP / dATP circa 5 volte inferiori e circa 15 volte inferiori    , rispettivamente, in PHA-PBM rispetto a R-PBM  .

È stata studiata la sequenza comparativa dell’aumento dell’attività enzimatica cellulare indotto da PHA: timidina chinasi >> uridina chinasi >> deossicitidina chinasi >> adenosina chinasi >> 5′-nucleotidasi.

Concludiamo che AZT, ddC e ddI esercitano un effetto antivirale sproporzionato a seconda dello stato di attivazione delle cellule bersaglio, ovvero ddI e ddC esercitano il loro effetto antivirale in modo più favorevole nelle cellule a riposo rispetto alle cellule attivate, mentre l’AZT protegge preferenzialmente le cellule attivate dall’infezione da HIV . Dato che la sintesi del DNA provirale dell’HIV-1 nei linfociti a riposo inizia a livelli paragonabili ai linfociti attivati, i dati attuali dovrebbero avere rilevanza pratica nella progettazione della chemioterapia anti-HIV, in particolare della chemioterapia combinata.

Polimerizzazione con bypass dell’addotto del DNA da parte di Dpo4 Sulfolobus solfataricus DNA polimerasi: analisi e strutture cristalline della sostituzione di coppie multi-base e prodotti di frame shift dell’1, N2-etenoguanina addotto.

1. , N (2) -Etheno (epsilon) guanina è un’alterazione mutagena del DNA derivata da prodotti di ossidazione dei lipidi e da alcuni agenti cancerogeni chimici. L’analisi elettroforetica su gel dei prodotti di estensione del primer di Sulfolobus solfataricus P2 (Dpo4) DNA polimerasi IV ha mostrato l’inclusione preferenziale dell’opposto 3 ‘- (1, N (2) -epsilon-G) TACT-5’ A tra i quattro dNTP testati individualmente. Con un 3 ‘matrice – (1, N (2) -epsilon-G) CACT-5’, sono stati inclusi sia G che A.
2. Quando l’estensione del primer è stata eseguita in presenza di una miscela di tutti e quattro i dNTP, la cromatografia liquida ad alta pressione-spettrometria di massa dei prodotti ha mostrato  che (al contrario di 3 ‘- (1, N (2) -epsilon-G) CACT-5 ‘) il prodotto principale era 5’ -GTGA-3 ′ e il prodotto secondario era 5′-AGTGA-3 ′.
3. Sulla matrice 3 ′ – (1, N (2) -epsilon-G) TACT-5 ′, i seguenti quattro prodotti sono stati identificati mediante cromatografia liquida ad alta pressione-spettrometria di massa: 5′-AATGA-3′, 5′-ATTGA -3′, 5′-ATGA-3′ e 5′-TGA-3′. La struttura cristallina dei raggi X di Dpo4 è stata risolta (2,1 A) con il modello di primer e A posizionato nel primer in modo che sia rivolto verso l’1, N (2) -epsilon-G nella matrice 3 ‘ – (1, N ( 2) – epsilon-G) SI 5 ′.

La A aggiunta nel sottofondo è stata accoppiata attraverso il modello a T con la classica geometria Watson-Crick. Strutture simili sono state osservate nel triplo complesso Dpo4-DNA-dATP e nel triplo complesso Dpo4-DNA-ddATP  ,   con d (d) ATP opposto al modello T. Una struttura simile è stata osservata con ddGTP adiacente al primer e opposto a C accanto a 1, N (2) -epsilon- G a 3 ′ – (1, N (2) -epsilon-G) CACT-5 ′. Abbiamo concluso che Dpo4 utilizza diversi meccanismi, inclusa l’incorporazione di A opposto a 1, N (2) -epsilon-G, nonché una variazione di disallineamento stabilizzata da dNTP, per generare mutazioni di coppia di basi e frame shift.

Identificazione dell’attività della telomerasi non di processo da cellule di topo.

L’attività della telomerasi è stata identificata in estratti di diverse linee cellulari di topo. L’aggiunta di ripetizioni telomeriche TTAGGG era specifica per i primer oligonucleotidici telomerici e sensibile al pretrattamento con RNasi A.

A differenza delle centinaia di ripetizioni sintetizzate dalla telomerasi umana e dagli enzimi Tetrahymen in vitro, la telomerasi del topo ha sintetizzato solo una o due ripetizioni TTAGGG su primer telomerici.

I prodotti osservati dopo l’estensione del primer con sequenze permutate circolarmente (TTAGGG) 3 e la terminazione della   catena ddATP   o ddTTP hanno indicato che la telomerasi murina si è fermata dopo l’aggiunta del primo residuo dG nella sequenza TTAGGG.

La breve lunghezza dei prodotti sintetizzati dalla telomerasi di topo non era dovuta a un inibitore della diffusione nell’estratto di topo, poiché la telomerasi umana continuava a sintetizzare prodotti lunghi quando mescolata con il topo.

Gli esperimenti di Primer Challenge hanno mostrato che l’enzima umano sintetizzava TTAGGG lunghe ripetizioni processivemente in vitro, mentre la telomerasi murina sembrava essere molto meno processiva. L’identificazione di prodotti corti di telomerasi negli estratti di topo suggerisce che anche gli estratti di altri organismi possono generare solo prodotti corti. Questa conoscenza può aiutare a identificare l’attività della telomerasi negli organismi per i quali l’attività non è stata ancora rilevata.

Resistenza alla 2′, 3′-dideossicitidina conferita da una mutazione al codone 65 della trascrittasi inversa di tipo 1 del virus dell’immunodeficienza umana.

La variante del virus dell’immunodeficienza umana resistente alla zalcitabina di tipo 1 (2 ′, 3′-dideossicitidina [ddC]) è stata selezionata mediante passaggi successivi in ​​presenza di concentrazioni crescenti di ddC in colture di cellule mononucleate del sangue periferico.

Una mutazione risultante nella sostituzione della lisina con l’arginina è stata notata nel codone 65 della trascrittasi inversa (RT) di questo virus selezionato dal ddC. Il virus mutante clonato con questa mutazione del codone 65 è stato costruito utilizzando un nuovo approccio PCR per la mutagenesi diretta al sito.

La caratterizzazione di questo virus ha confermato che la sostituzione di RT Lys-65 – >> Arg era necessaria e sufficiente per quadruplicare la concentrazione inibitoria di ddC del 50%, così come la resistenza alla didanosina (2′, 3′-dideossiinosina [ddI ]). ). Lys-65 – >> Arg e resistenza del virus a ddC e ddI si sono sviluppati anche durante il trattamento in isolati da un paziente trattato con ddC e due pazienti trattati con ddI.