Un vettore versatile per il trasferimento di geni e oligonucleotidi nelle cellule in coltura e in vivo

Misurazione della mobilità mediante l’analisi della cinetica del recupero della fluorescenza del fotosbiancamento. Il recupero della candeggina fluorescente (FPR) è un metodo per misurare la mobilità laterale bidimensionale   delle particelle  fluorescenti  , ad esempio il movimento di  molecole marcate  in modo fluorescente  in circa 10 aree mum2 di una singola superficie cellulare.

1. Un piccolo punto su una  superficie fluorescente   viene fotosbiancato mediante una breve esposizione a un raggio laser intensamente focalizzato, quindi il recupero della fluorescenza viene monitorato dallo stesso raggio laser indebolito.
2. Il recupero avviene reintegrando un fluoroforo intatto in un’area sbiadita mediante trasporto laterale dalla superficie circostante  . Presentiamo il background teorico e alcuni suggerimenti pratici per un’analisi semplice e rigorosa degli esperimenti FPR.
3. Le informazioni ottenute dagli esperimenti FPR comprendono: (a) l’identificazione del tipo di processo di trasporto, ovvero la miscela di diffusione casuale e flusso diretto omogeneo; (b) determinare il coefficiente di mobilità assoluto, ovvero la costante di diffusione e/o la velocità del flusso; e (c) una porzione del fluoroforo totale che è mobile.
4. Per illustrare il metodo sperimentale e per convalidare la teoria della diffusione, descriviamo diversi esperimenti modello su soluzioni acquose di 6G rodamina.

Analisi precisa della posizione in nanometri per singole  sonde fluorescenti.

1. Il calcolo del baricentro delle immagini di singole   particelle e particelle  fluorescenti    consente la localizzazione e il tracciamento nei microscopi ottici con una precisione di un ordine di grandezza maggiore della risoluzione del microscopio.
2. Sono stati studiati i fattori che limitano la precisione di queste tecniche ed è stata derivata una semplice equazione per descrivere la precisione della localizzazione in un’ampia gamma di condizioni. Inoltre  , viene costruito e testato un algoritmo di localizzazione basato sulla teoria della corrispondenza dei minimi quadrati sia su stack di immagini di  sfere fluorescenti da 30 nm   che su immagini generate al computer  (simulazioni Monte Carlo).
3. I risultati dell’algoritmo mostrano un buon accordo con l’equazione di precisione ottenuta sia per la simulazione che per le immagini reali.
4. La disponibilità di una semplice equazione che descrive la precisione della localizzazione aiuta i ricercatori sia a valutare la qualità dell’attrezzatura sperimentale sia a prestare attenzione ai fattori che limitano l’ulteriore miglioramento. L’accuratezza della localizzazione viene scalata come l’inverso della radice quadrata del numero di fotoni in atto per il caso di riduzione del rumore di scatto e come reciproco del numero di fotoni per il caso di rumore di fondo ridotto.
5. L’ingrandimento ottimale di un’immagine dipende dal numero previsto di fotoni e dal rumore di fondo, ma nella maggior parte dei casi la dimensione dei pixel dovrebbe essere approssimativamente uguale alla deviazione standard della funzione di dispersione del punto.

Interiorizzazione delle particelle dipendente dalla dimensione   attraverso le vie di endocitosi clatrina-caveola-dipendente .  

1. Le cellule eucariotiche non fagocitiche possono interiorizzare   particelle di dimensioni  <1 micron, inclusi agenti patogeni, liposomi di rilascio di farmaci o lipoplessi utilizzati per il rilascio di geni.
2. Nel presente studio, abbiamo esaminato l’effetto della dimensione delle  particelle   sulla via di ingresso e il destino intracellulare a valle nelle cellule B16 non fagocitiche utilizzando una serie di   sfere di lattice fluorescenti   di dimensioni specifiche (50-1000 nm).
3. I nostri dati rivelano che   particelle   grandi fino a 500 nm sono state interiorizzate dalle cellule in un processo dipendente dall’energia. Con l’aumento delle dimensioni (50-500 nm), la perdita di colesterolo ha aumentato l’efficacia dell’inibizione dell’assorbimento.
4. L’elaborazione delle   particelle più piccole   è stata significativamente compromessa dall’interruzione dei microtubuli, con scarso effetto sulle sfere da 500 nm  .
5. Studi sugli inibitori e sulla co-localizzazione hanno mostrato che il meccanismo dell’internalizzazione delle perline e il loro successivo targeting intracellulare dipendeva fortemente dalla dimensione delle  particelle   . L’interiorizzazione di microsfere <200 nm di diametro ha interessato fossette ricoperte di clatrina.
6. Con l’aumento delle dimensioni, è diventato evidente il passaggio a un meccanismo di interiorizzazione mediato dalla caveola, che è diventato il percorso dominante   per la penetrazione di particelle   da 500 nm .
7. In queste condizioni, la consegna ai lisosomi non era più visibile. I dati indicano che la sola dimensione delle particelle (prive di ligando)     può determinare la via di ingresso.
8. La via dell’endocitosi mediata dalla clatrina mostra un limite di dimensioni superiori per l’internalizzazione di ca. 200 nm, ed i parametri cinetici possono determinare l’internalizzazione quasi esclusiva di tali   particelle   lungo questo percorso e non attraverso le caveole.

Immunofluorescenza nelle cellule derivate dal linfoma di Burkitt.

Henle, Gertrude (Children’s Hospital di Filadelfia, Filadelfia, Pennsylvania) e Werner Henle. Immunofluorescenza nelle cellule derivate dal linfoma di Burkitt. J. batteriolo. 91: 1248-1256. 1966.-I test di immunofluorescenza indiretta hanno portato alla colorazione eccellente di una piccola frazione di cellule in cinque diverse colture derivate da linfomi di Burkitt (africano).

La risposta non si è limitata a 17 sieri di casi di questa malattia, ma si è estesa a molti sieri di persone americane, sia da donatori sani che da pazienti affetti da varie malattie. L’incidenza dei sieri positivi è aumentata con l’età da circa il 30% nell’infanzia al >> 90% negli adulti. Le gamma-globuline umane accoppiate all’isotiocianato di fluoresceina erano adatte per la colorazione diretta della stessa proporzione di cellule.

Le cellule colorate sembravano trovarsi in diversi stadi di degenerazione, ma le condizioni di coltura che portavano ad un aumento della percentuale di morte cellulare non hanno comportato un aumento delle  cellule fluorescenti. Diverse osservazioni suggeriscono che le cellule di colorazione potrebbero essere quelle in cui   le particelle virali sono visibili  al microscopio elettronico.

Anche due linee cellulari di pazienti affetti da leucemia in questo paese contenevano una piccola frazione di cellule colorabili, ma altre due e numerose colture primarie di leucociti umani hanno dato risultati costantemente negativi. I tentativi di associare la colorazione con antigeni virali noti sono falliti a causa di herpes simplex, varicella, citomegalovirus e reo tipi 1, 2 e 3. Restano da determinare la natura del virus trasmesso dalle cellule di linfoma e le reazioni di colorazione.

Diversi policationi con una capacità tamponante significativa al di sotto del pH fisiologico, come lipopoliammine e polimeri di poliammidoammina, sono agenti di trasfezione efficaci di per sé, cioè senza l’aggiunta di alcun targeting cellulare o agenti di distruzione della membrana.

• Questa osservazione ci ha spinto a testare il polimero cationico di polietilenimmina (PEI) per il suo potenziale di consegna genica. In effetti,  ogni terzo atomo di PEI è un atomo di azoto amminico protonabile, il che rende la rete polimerica un’efficace “spugna protonica” praticamente a qualsiasi pH. Il trasferimento del gene reporter della luciferasi con questo policatione a varie linee cellulari e cellule primarie ha dato risultati paragonabili o addirittura migliori delle lipopoliammine.
• La citotossicità era bassa e osservata solo a concentrazioni ben al di sopra di quelle richieste per una trasfezione ottimale. Dopo la consegna degli oligonucleotidi ai neuroni embrionali,  è stata utilizzata una sonda fluorescente. Praticamente tutti i neuroni hanno mostrato un’etichettatura nucleare, senza effetti tossici. L’equilibrio cationico/anionico ottimale di PEI per la trasfezione in vitro è solo leggermente sul lato cationico, che è favorevole per la consegna in vivo.

In effetti, il trasferimento intracerebrale del gene della luciferasi in topi neonati ha dato risultati paragonabili (per una data quantità di DNA) alla trasfezione in vitro di cellule endoteliali primarie di cervello di ratto o neuroni di embrioni di pollo. Insieme, queste proprietà rendono il PEI un promettente vettore di terapia genica e un eccellente core per la progettazione di dispositivi più sofisticati. La nostra ipotesi è che la sua efficacia si basi sul tamponamento intensivo dei lisosomi, che protegge il DNA dalla degradazione da parte delle nucleasi e, di conseguenza, dal rigonfiamento e dalla rottura dei lisosomi, che forniscono un meccanismo di fuga per   le particelle di  PEI/DNA .