Correzione di un disadattamento specifico del filamento in estratti nucleari di linee cellulari umane e Drosophila melanogaster

È stato riscontrato che estratti nucleari derivati ​​​​da linee cellulari HeLa e Drosophila melanogaster KC correggono gli errori di una singola coppia di basi negli eteroduplex di DNA circolari aperti contenenti incisioni specifiche del filamento e sito-specifiche situate a 808 bp dalla mancata corrispondenza. La correzione in entrambi i sistemi di estrazione è specifica del filamento, essendo altamente polarizzata rispetto al filamento di DNA tagliato.

Diversi disallineamenti all’interno dell’insieme omologo di eteroduplex sono stati elaborati con efficienze diverse (GT maggiore di G.  G approssimativamente uguale a AC maggiore di CC) e la correzione è stata accompagnata dalla sintesi del DNA dipendente dal disadattamento situata nella regione di disadattamento e rottura del filamento, mostrando in tal modo il riconoscimento di una non conformità è correlato a una risposta riparativa.

• • • Ciascuno di questi eteroduplex è stato corretto dall’afidicolina, ma era relativamente insensibile alla presenza di alti livelli di   ddTTP  , indicando il possibile coinvolgimento dell’alfa e/o delta DNA polimerasi. Questi risultati suggeriscono che le cellule eucariotiche superiori possiedono un sistema di riparazione del disadattamento generale e specifico del filamento analogo alle vie Escherichia coli mutHLS e Streptococcus pneumoniae hexAB, sistemi che contribuiscono in modo significativo alla stabilità genetica di queste specie batteriche.
    • Il sistema di replicazione del DNA dell’adenovirus in vitro ha catalizzato la formazione di un complesso covalente tra la proteina 80.000 dalton e la 5′-dCMP in presenza di DNA [alfa-32P-dCTP, MgCl2, ATP e adenovirus (Ad) con una proteina covalente legata a l’estremità 5′ di ciascun filamento (DNA prot Ad).
    • I requisiti di Ad DNA prot in questa reazione erano simili a quelli per la replicazione del DNA in vitro Quando dATP, dTTP e ddGTP 2′, 3′-dideossinucleoside trifosfato (ddNTP) sono stati incorporati nella miscela di reazione, è stato rilevato un complesso allungato che consisteva di una proteina di lunghezza 80.000 dalton associata a un oligonucleotide a 26 basi. La formazione di un prodotto allungato, ma non di un complesso proteina-dCMP, è stata inibita da ddATP, ddCTP o   ddTTP I requisiti per la formazione del complesso proteina-dCMP, la natura del legame tra la proteina e il dCMP, la dimensione della proteina e l’esistenza delle forme allungate indicavano che la proteina associata al complesso era identica alla proteina terminale Ad di 80.000 dalton trovato sulla replicazione di molecole di DNA come descritto in Challberg et al. [Chalberg, MD, Desiderio, SV & Kelly, TJ, Jr. (1980) Proc. Natl. Accad. Scienza. USA 77, 5105-5109].

Identificazione dell’attività della telomerasi non di processo da cellule di topo.

L’attività della telomerasi è stata identificata in estratti di diverse linee cellulari di topo. L’aggiunta di ripetizioni TTAGGG telomeriche era specifica per primer oligonucleotidici telomerici e sensibile al pretrattamento con RNasi A. A differenza delle centinaia di ripetizioni sintetizzate in vitro dagli enzimi telomerasi e tetraimene umana, la telomerasi di topo sintetizzava solo una o due ripetizioni TTAGGG su primer telomerici.

I prodotti osservati dopo l’estensione del primer con sequenze permutate circolarmente (TTAGGG) 3 e la terminazione della catena ddATP o   ddTTP hanno   indicato che la telomerasi murina si è fermata dopo l’aggiunta del primo residuo dG nella sequenza TTAGGG.

La breve lunghezza dei prodotti sintetizzati dalla  telomerasi murina non era dovuta all’inibitore della diffusione nell’estratto di topo poiché la telomerasi umana continuava a sintetizzare prodotti lunghi quando mescolata con le frazioni murine.

Gli esperimenti di Primer Challenge hanno mostrato che l’enzima umano sintetizzava TTAGGG lunghe ripetizioni processivemente in vitro, mentre la telomerasi murina sembrava essere molto meno processiva. L’identificazione di prodotti corti di telomerasi negli estratti di topo suggerisce che anche gli estratti di altri organismi possono generare solo prodotti corti. Questa conoscenza può aiutare a identificare l’attività della telomerasi negli organismi per i quali l’attività non è stata ancora rilevata.

Ricostituzione funzionale della telomerasi tetrahymen mutante e wild-type.

La telomerasi è una ribonucleoproteina che catalizza l’estensione dei telomeri in vitro e in vivo. Il componente 159-nucleotide RNA della Tetrahymena telomerase contiene la sequenza 5′-CAACCCCAA-3 ′ (“regione del modello”) che funge da modello per l’aggiunta della sequenza d (TTGGGG) n ai telomeri di Tetrahymena.

Per  studiare il meccanismo dell’enzima Tetrahymena telomerasi, abbiamo sviluppato un test funzionale di ricostituzione in vitro. Dopo la rimozione dell’RNA della telomerasi essenziale mediante digestione con nucleasi micrococcica  della telomerasi parzialmente purificata, l’aggiunta di RNA della telomerasi trascritta in vitro ha ripristinato l’attività della telomerasi.

L’attività rigenerata era specifica del processo e mostrava la stessa specificità del primer della telomerasi nativa. I mutanti nella regione del modello di RNA sono stati testati in saggi di ricostituzione per determinare il ruolo dei residui in questa regione nel riconoscimento e nell’estensione del primer.

Due mutanti stampo, codificanti per le sequenze 5′-UAACCCCAA-3′ e 5′-UAACCCUAA-3′, hanno determinato l’inclusione di dATP nella sequenza d (TTAGGG). La telomerasi ricostituita con il mutante stampo che codifica per la sequenza 5′-CAACCCUAA-3′ non includeva l’incorporazione di dATP e l’allungamento di questo mutante non è stato interrotto dall’aggiunta di ddATP.

prodotto non trovato.

Inoltre, il mutante modello che codifica per la sequenza 5′-CGGCCCCAA-3 ′ specificava l’inclusione di ddCTP ma non   ddTTP   , mentre il mutante che codifica per la sequenza 5′-CAACCCCGG-3 ′ specificava l’inclusione di   ddTTP  ma non ddCTP. Questi dati suggeriscono che solo i residui 5′-sei della regione del modello determinano l’aggiunta di ripetizioni telomeriche.