Identyfikacja nieprocesowej aktywności telomerazy z komórek myszy.

Aktywność telomerazy zidentyfikowano w ekstraktach z kilku różnych mysich linii komórkowych. Dodanie telomerowych powtórzeń TTAGGG było specyficzne dla telomerowych starterów oligonukleotydowych i wrażliwe na wstępne traktowanie RNazą A.

W przeciwieństwie do setek powtórzeń zsyntetyzowanych przez enzymy telomerazy ludzkiej i Tetrahymena in vitro, mysia telomeraza zsyntetyzowała tylko jedno lub dwa powtórzenia TTAGGG na telomerycznych starterach.

Produkty obserwowane po wydłużeniu starterów z sekwencjami permutowanymi kołowo (TTAGGG)3 i po zakończeniu łańcucha  ddATP  lub ddTTP wskazywały, że mysia telomeraza zatrzymuje się po dodaniu pierwszej reszty dG w sekwencji TTAGGG.

Krótka długość produktów syntetyzowanych przez mysią telomerazę nie była spowodowana dyfuzyjnym inhibitorem w mysim ekstrakcie, ponieważ ludzka telomeraza nadal syntetyzowała długie produkty po zmieszaniu z mysią.

Eksperymenty z prowokacją starterów wykazały, że ludzki enzym syntetyzował długie powtórzenia TTAGGG procesowo in vitro, podczas gdy mysia telomeraza wydawała się być znacznie mniej procesywna. Identyfikacja krótkich produktów reakcji telomerazy w ekstraktach mysich sugeruje, że ekstrakty z innych organizmów również mogą generować tylko krótkie produkty. Wiedza ta może pomóc w identyfikacji aktywności telomerazy w organizmach, których aktywność nie została jeszcze wykryta.

System replikacji DNA adenowirusa Rt pcrAn in vitro katalizował tworzenie kowalencyjnego kompleksu między białkiem o długości 80 000 daltonów i 5′-dCMP w obecności DNA [alfa-32P-dCTP, MgCl2, ATP i adenowirusa (Ad) z białkiem kowalencyjnie związany z końcem 5′ każdej nici (prot DNA Ad).

Wymagania dotyczące prot DNA Ad w tej reakcji były podobne do wymagań replikacji DNA in vitro. Gdy dATP, dTTP i ddGTP 2′,3′-dideoksynukleozydotrifosforan (ddNTP) zostały włączone do mieszaniny reakcyjnej, wykryto wydłużony kompleks, który składał się z białka o długości 80 000 daltonów związanego z 26-zasadowym oligonukleotydem.

Tworzenie wydłużonego produktu, ale nie kompleksu białko-dCMP, było hamowane przez  ddATP , ddCTP lub ddTTP. Wymagania dotyczące tworzenia kompleksu białko-dCMP, charakter wiązania między białkiem a dCMP, wielkość białka oraz istnienie wydłużonych form wskazywały, że białko związane z kompleksem było identyczne z terminalem Ad o długości 80 000 daltonów białko znalezione na replikujących się cząsteczkach DNA, jak opisano w Challberg et al. [Challberg, MD, Desiderio, SV & Kelly, TJ, Jr. (1980) Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 77, 5105-5109].

Różnicowa fosforylacja azydotymidyny, dideoksycytydyny i dideoksyinozyny w spoczynkowych i aktywowanych jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej.

Aktywność przeciwwirusową azydotymidyny (AZT), dideoksycytydyny (ddC) i dideoksyinozyny (ddI) wobec HIV-1 oceniono porównawczo w PBM stymulowanym PHA.

Średnie stężenie leku, które dało 50% hodowli ujemnych pod względem p24 Gag było zasadniczo różne: 0,06, 0,2 i 6 mikroM odpowiednio dla AZT, ddC i ddI. Odkryliśmy, że AZT była preferencyjnie fosforylowana do postaci trifosforanu (TP) w PHA-PBM, a nie niestymulowanym, spoczynkowym PBM (R-PBM), wytwarzając 10- do 17-krotnie wyższy stosunek AZTTP/dTTP w PHA-PBM niż w R -PBM.

Fosforylacja ddC i ddI do ich form TP była jednak znacznie mniej wydajna w PHA-PBM, co skutkowało około 5-krotnie i około 15-krotnie niższymi stosunkami odpowiednio ddCTP/dCTP i  ddATP /dATP w PHA-PBM niż w R-PBM .

Zbadano kolejność porównawczą indukowanego przez PHA wzrostu aktywności enzymów komórkowych: kinaza tymidynowa>>kinaza urydynowa>>kinaza deoksycytydynowa>>kinaza adenozynowa>> 5′-nukleotydaza.

Wnioskujemy, że AZT, ddC i ddI wywierają nieproporcjonalne działanie przeciwwirusowe w zależności od stanu aktywacji komórek docelowych, tj. ddI i ddC wywierają działanie przeciwwirusowe korzystniej w komórkach w spoczynku niż w komórkach aktywowanych, podczas gdy AZT preferencyjnie chroni aktywowane komórki przed zakażeniem HIV . Biorąc pod uwagę, że synteza prowirusowego DNA wirusa HIV-1 w spoczynkowych limfocytach rozpoczyna się na poziomach porównywalnych z aktywowanymi limfocytami, obecne dane powinny mieć praktyczne znaczenie w projektowaniu chemioterapii przeciw HIV, zwłaszcza chemioterapii skojarzonej.

Polimeryzacja z obejściem adduktu DNA przez polimerazę DNA Dpo4 Sulfolobus solfataricus: analiza i struktury krystaliczne produktów podstawienia wielu par zasad i przesunięcia ramki z adduktem 1,N2-etenoguaniną.

1. ,N(2)-Etheno(epsilon)guanina jest mutagenną zmianą DNA pochodzącą z produktów utleniania lipidów, a także z niektórych chemicznych czynników rakotwórczych. Analiza elektroforetyczna w żelu produktów wydłużania startera przez polimerazę IV DNA Sulfolobus solfataricus P2 (Dpo4) wykazała preferencyjne włączenie A przeciwnego 3′-(1,N(2)-epsilon-G)TACT-5′, wśród czterech testowanych dNTP indywidualnie. Z matrycą 3′-(1,N(2)-epsilon-G)CACT-5′, zarówno G, jak i A zostały włączone.
2. Gdy wydłużanie startera przeprowadzono w obecności mieszaniny wszystkich czterech dNTP, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa-spektrometria masowa produktów wykazała , że ​​(przeciwieństwo 3′-(1,N(2)-epsilon-G)CACT-5′ ) głównym produktem był 5′-GTGA-3′, a drugorzędnym produktem był 5′-AGTGA-3′.
3. Na matrycy 3′-(1,N(2)-epsilon-G)TACT-5′, następujące cztery produkty zostały zidentyfikowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej-spektrometrii masowej: 5′-AATGA-3′, 5′-ATTGA -3′, 5′-ATGA-3′ i 5′-TGA-3′. Rentgenowska struktura krystaliczna Dpo4 została rozwiązana (2,1 A) za pomocą szablonu startera i A umieszczonego w starterze tak, aby znajdował się naprzeciwko 1,N(2)-epsilon-G w matrycy 3′-(1,N( 2)-epsilon-G)TAK 5′.

Dodany A w podkładzie został sparowany w poprzek szablonu T z klasyczną geometrią Watsona-Cricka. Podobne struktury zaobserwowano w potrójnym kompleksie Dpo4-DNA-dATP i potrójnym kompleksie Dpo4-DNA- ddATP  , z d(d)ATP naprzeciwko matrycy T. Podobną strukturę zaobserwowano z ddGTP sąsiadującym ze starterem i naprzeciwko C obok 1,N(2)-epsilon-G w 3′-(1,N(2)-epsilon-G)CACT-5′. Doszliśmy do wniosku, że Dpo4 wykorzystuje kilka mechanizmów, w tym inkorporację A naprzeciwko 1,N(2)-epsilon-G, a także odmianę niewspółosiowości stabilizowanej przez dNTP, do generowania mutacji zarówno par zasad, jak i przesunięcia ramki.

Oporność na 2′,3′-dideoksycytydynę nadaną przez mutację w kodonie 65 odwrotnej transkryptazy ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1.

Wariant ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 oporny na zalcytabinę (2′,3′-dideoksycytydyna [ddC]) został wyselekcjonowany przez kolejne pasaże w obecności wzrastających stężeń ddC w hodowlach komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Mutacja powodująca podstawienie lizyny do argininy została zauważona w kodonie 65 odwrotnej transkryptazy (RT) tego wirusa selekcjonowanego pod względem ddC. Sklonowany zmutowany wirus z tą mutacją kodonu 65 został skonstruowany przy użyciu nowego podejścia PCR do ukierunkowanej mutagenezy.

Charakterystyka tego wirusa potwierdziła, że ​​podstawienie RT Lys-65->>Arg było konieczne i wystarczające do czterokrotnego wzrostu stężenia hamującego ddC 50%, a także oporności na didanozynę (2′,3′-dideoksyinozynę [ddI]). ). Lys-65->>Arg i oporność wirusa na ddC i ddI również rozwinęła się podczas terapii w izolatach od jednego pacjenta leczonego ddC i dwóch pacjentów leczonych ddI.

Zmutowany enzym RT kodonu 65 ulegający ekspresji zrekombinowanej był oporny na ddCTP i  ddATP  w testach bezkomórkowej polimerazy. Wyniki badań zmutowanych enzymów są zgodne z Lys-65->>Arg, co prowadzi do zmian w wiązaniu form trifosforanowych tych analogów nukleozydów do RT. Dane te mają znaczenie dla przyszłych badań nad opornością na ddC, szczególnie tych mających na celu określenie jej znaczenia klinicznego.