Scoperta di doppi inibitori per il tipo selvaggio e il mutante D816V della chinasi c-KIT attraverso lo screening virtuale e biochimico dei prodotti naturali

Sebbene la chinasi del recettore del fattore delle cellule staminali (c-KIT) sia responsabile di vari tumori umani maligni, la presenza di mutanti con guadagno di funzione costitutivamente attivi ha reso difficile la scoperta di nuovi agenti antitumorali utilizzando c-KIT come proteina bersaglio. Per identificare i comuni inibitori del c-KIT wild-type e il mutante gain-of-function più abbondante (D816V), è stato eseguito lo screening virtuale dei prodotti naturali per le due proteine bersaglio in parallelo con la funzione di punteggio migliorata implementando un sofisticato termine di energia libera di solvatazione.
Di conseguenza, si trovano quattro comuni inibitori di origine naturale con potenze biochimiche che vanno da bassi livelli micromolari a submicromolari. I risultati di ampie simulazioni di attracco mostrano che sebbene gli inibitori del prodotto naturale stabiliscano interazioni idrofobiche più deboli con il mutante D816V rispetto al tipo selvatico, mostrano un’attività inibitoria leggermente superiore per il primo rispetto al secondo rafforzando le interazioni del legame idrogeno a un misura sufficiente.
Dei quattro inibitori del prodotto naturale, si prevede che (Z) -6-idrossi-2- (4-metossibenzilidene) benzofuran-3 (2H) -one (3) serva come nuovo nucleo molecolare per gli studi sulla relazione struttura-attività per ottimizzare le potenze biochimiche perché mostra una buona attività inibitoria sia contro il tipo selvatico che contro il mutante D816V nonostante il suo basso peso molecolare (268,3 del mattino).

Analisi molecolari e biochimiche dei recettori del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR) B, PDGFRA e dei recettori KIT nei cordomi

 

OBBIETTIVO
Abbiamo precedentemente dimostrato la presenza di un recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) attivato (PDGFR) B e del suo ligando PDGFB in un numero limitato di pazienti con risposte cliniche e radiologiche al trattamento con imatinib mesilato. Questo articolo descrive i risultati di analisi molecolari/biochimiche complete dei tre recettori mirati dal farmaco (PDGFRB, PDGFRA e KIT) in una serie di 31 pazienti con cordoma.
METODI
La presenza e lo stato di attivazione dei recettori PDGFRB, PDGFRA e KIT sono stati studiati mediante immunoprecipitazione e analisi Western blot integrate da immunoistochimica, il loro livello di espressione è stato analizzato mediante PCR in tempo reale e l’insorgenza di mutazioni puntiformi attivanti è stata studiata da mezzo di sequenziamento del cDNA. I ligandi affini del PDGFB, del PDGFA e del fattore delle cellule staminali sono stati studiati mediante PCR di trascrizione inversa e lo stato del gene è stato valutato mediante ibridazione in situ a fluorescenza.
RISULTATI
I risultati mostrano che PDGFRB era altamente espresso e fosforilato, mentre PDGFRA e KIT erano meno espressi ma fosforilati e quindi attivati. Questi risultati, insieme all’assenza di mutazioni di guadagno di funzione e alla presenza dei ligandi affini, supportano fortemente l’ipotesi che il meccanismo di attivazione sia il ciclo autocrino/paracrino. Nessun ruolo sembra essere giocato dall’amplificazione genica.
CONCLUSIONI
Alla luce dei nostri risultati, il beneficio clinico osservato nei pazienti con cordoma trattati con imatinib sembra essere attribuibile allo spegnimento di tutti e tre i recettori.

Analisi enzimatica/biochimica di Actinomyces con kit di test commerciali con enfasi sulle specie appena descritte.

Nei laboratori di microbiologia clinica, l’identificazione di batteri simili ad Actinomyces può essere molto laboriosa e problematica. Nel presente studio, ci siamo concentrati sui modelli di reattività di 4 kit di test commerciali, RapID ANA II, RapID 32A, RapID CB Plus e BBL Crystal ANR ID, che potrebbero essere utilizzati per una rapida identificazione preliminare degli isolati di Actinomyces appartenenti a Actinomyces appena descritti e specie strettamente imparentate. Dei 54 ceppi testati, 25 ceppi (46%) sono stati correttamente identificati a livello di genere/gruppo dal sistema BBL Crystal ANR ID, 16 ceppi (30%) da RapID 32 A, 11 ceppi (20%) da RapID CB Plus e 7 ceppi (13%) di RapID ANA II. I problemi principali con questi kit erano dovuti a occasionali deboli reazioni enzimatiche e di fermentazione dello zucchero. In conclusione, la sensibilità e la specificità del substrato cromogenico devono essere migliorate al fine di migliorare l’affidabilità dei risultati dei test di questi kit e il presente database aggiornato al fine di identificare con maggiore precisione Actinomyces appena descritti e specie strettamente correlate.

WinBEST-KIT: Simulatore di reazioni biochimiche basato su Windows per le vie metaboliche

 

Abbiamo implementato un simulatore di reazione biochimica efficiente e di facile utilizzo chiamato BEST-KIT basato sul Web (Biochemical Engineering System Analyzing Tool-KIT) per l’analisi di reti non lineari su larga scala come le vie metaboliche. Gli utenti possono facilmente progettare e analizzare uno schema di reazione arbitrario tramite Internet e un’interfaccia utente grafica efficiente senza considerare le equazioni matematiche.
Lo schema di reazione può includere diversi tipi di reazione, che sono rappresentati sia dalla legge di azione di massa (bilancio di massa) che dalle funzioni di velocità approssimata della cinetica enzimatica allo stato stazionario, come Michaelis-Menten, cooperativa di Hill, inibizione competitiva.
Tuttavia, poiché tutti i moduli del BEST-KIT basato sul Web sono stati sviluppati in stile applet Java, gli utenti non possono facoltativamente utilizzare equazioni matematiche originali oltre alle equazioni preparate. Nel presente studio, abbiamo sviluppato una nuova versione di BEST-KIT (per Microsoft Windows chiamata WinBEST-KIT) per consentire agli utenti di definire equazioni matematiche originali e personalizzare queste equazioni molto facilmente come simboli di reazione definiti dall’utente.
I seguenti potenti metodi di analisi del sistema sono preparati per l’analisi del sistema: calcolo del corso del tempo, scansione dei parametri, stima dei valori di parametri cinetici sconosciuti basati su dati del corso del tempo dei reagenti osservati sperimentalmente, risposta dinamica dei reagenti contro perturbazioni esterne virtuali , e la simulazione in tempo reale (Virtual Dry Lab).

Sovrapposizione mediata da c-Kit e risultati funzionali e biochimici unici attraverso diverse vie di segnalazione

Un problema critico nella comprensione della segnalazione del recettore tirosina chinasi è il contributo individuale di diverse vie di segnalazione nella regolazione della crescita cellulare, della sopravvivenza e della migrazione. Abbiamo generato un recettore c-Kit funzionalmente e biochimicamente inerte che mancava dei siti di legame per sette vie di segnalazione precoci. Il ripristino dei siti di legame della famiglia Src della chinasi (SFK) nel recettore c-Kit mutato ha ripristinato la sopravvivenza e la migrazione cellulare ma ha salvato solo parzialmente la proliferazione ed è stato associato al salvataggio della chinasi della proteina attivata da Ras / mitogeno, della chinasi Rac / JNK e del fosfatidilinositolo 3-chinasi (chinasi PI-3) / vie Akt.
Al contrario, il ripristino del sito di legame della chinasi PI-3 nel recettore mutato non ha influenzato la proliferazione cellulare ma ha comportato una modesta correzione nella sopravvivenza e migrazione cellulare, nonostante un completo salvataggio nell’attivazione della via della chinasi PI-3 / Akt. Sorprendentemente, il ripristino dei siti di legame per Grb2, Grb7 o fosfolipasi C-gamma non ha avuto alcun effetto sulla crescita cellulare o sulla sopravvivenza, sulla migrazione o sull’attivazione di nessuna delle vie di segnalazione a valle. Questi risultati sostengono che gli SFK svolgono un ruolo unico nel controllo di molteplici funzioni cellulari e nell’attivazione di percorsi biochimici distinti tramite c-Kit.

BSA Standard kits

TBS5002 Tribioscience 7x 1ml 45 EUR

Blocking Buffer and Antibody Diluent for Dot Blot and Western Blot Kits

WB-B003 PHOENIX PEPTIDE 50 ml 66.96 EUR

TBST, pH7.6 - Buffer for Dot Blot and Western Blot Kits

WB-B001 PHOENIX PEPTIDE 100 ml 25.92 EUR

TBS, pH7.6 - Buffer for Dot Blot and Western Blot Kits

WB-B002 PHOENIX PEPTIDE 50 ml 18.36 EUR

Detection Reagent A for Dot Blot and Western Blot Kits

WB-B006 PHOENIX PEPTIDE 30 ml 86.4 EUR

Detection Reagent B for Dot Blot and Western Blot Kits

WB-B007 PHOENIX PEPTIDE 30 ml 86.4 EUR

Basic Cytotoxicity Test Kits

CT17001 Neuromics 125 Tests 490.8 EUR

Basic Cytotoxicity Test Kits

CT17002 Neuromics 250 Tests 780 EUR

Total Cytotoxicity Test Kits

CT17003 Neuromics 125 Tests 615.6 EUR

Total Cytotoxicity Test Kits

CT17004 Neuromics 250 Tests 975.6 EUR

T&A Cloning Kits

FYC001-20P Yeastern Biotech 1 vial Ask for price

Necrosis vs Apoptosis Kits

KF17371 Neuromics 50-100 Tests 522 EUR

Necrosis vs Apoptosis Kits

KF17372 Neuromics 100-200 Tests 921.6 EUR

EdU Imaging Kits (Cy3)

K1075-50 ApexBio 50-500 tests 240 EUR

EdU Imaging Kits (Cy5)

K1076-50 ApexBio 50-500 tests 240 EUR

EdU Imaging Kits (488)

K1175-50 ApexBio 50-500 tests 240 EUR

Uncoated Ancillary Reagent Kits

RK04587 Abclonal 20Plates 280 EUR

Sealed Vials Calibration Kits - EACH

2659505 Scientific Laboratory Supplies EACH 1013.85 EUR

MitoPT™ TMRE & TMRM Kits

KF17358 Neuromics 500 Test 574.8 EUR

MitoPT™ TMRE & TMRM Kits

KF17359 Neuromics 500 Test 574.8 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11259)

OKSA11259 Aviva Systems Biology 50 Tests 678 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11260)

OKSA11260 Aviva Systems Biology 150 Tests 1602 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11261)

OKSA11261 Aviva Systems Biology 500 Tests 2422.8 EUR

Rat Neural Stem Cell Kits

PC37123 Neuromics 1 X 10(6) *minimum order 6 vials* 1148.4 EUR

HiPer® Teaching Kits-Handbook

MBTL001-1NO EWC Diagnostics 1 unit 11.97 EUR

 

 

 

 

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