PCR digitale con partizione virtuale per applicazioni di conteggio cromosomico ad alta precisione

È stato sviluppato un prototipo di un sistema per il rilevamento di agenti patogeni infettivi della polmonite umana basato sulla PCR a trascrizione inversa in fase solida multiplex (RT-PCR). I primer sono stati progettati per identificare il DNA di sei ceppi di patogeni della polmonite batterica e l’RNA di due patogeni virali della polmonite: influenza A e SARS-CoV-2. L’accumulo di segnale di primer immobilizzati allungati si verifica a causa dell’incorporazione di nucleotidi marcati in modo fluorescente nella catena.

Il segnale viene rilevato dopo che tutti i componenti della miscela sono stati rimossi, il che riduce significativamente il segnale di fondo e aumenta la sensibilità dell’analisi. L’uso di un rilevatore specializzato consente di leggere i segnali dei primer allungati direttamente attraverso la pellicola di copertura trasparente della camera di reazione. Questa soluzione è progettata per prevenire la contaminazione incrociata ed è adatta per il test simultaneo di un gran numero di campioni di prova. La piattaforma proposta è in grado di rilevare la presenza di diversi patogeni della polmonite in un campione e ha un’architettura aperta che consente l’espansione della gamma di batteri e virus patogeni rilevabili.

Contesto: Nei pazienti con malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), la stratificazione del rischio basata sulla presentazione clinica, sulla comorbidità e sui parametri di laboratorio combinati è essenziale per fornire un’adeguata, intervento tempestivo basato sulle condizioni di un individuo per prevenire la mortalità tra i casi.

Metodi: è stato condotto uno studio osservazionale retrospettivo da giugno a ottobre 2020, includendo tutti i non sopravvissuti alla reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa (RT-PCR) positivi al COVID-19 e sopravvissuti del gruppo di controllo selezionati casualmente dopo la corrispondenza per età e sesso. Le informazioni cliniche e demografiche sono state raccolte dalle cartelle cliniche. Le variabili categoriali sono state espresse per frequenza e percentuale. Per esplorare i fattori di rischio associati alla mortalità, sono stati utilizzati modelli di regressione logistica univariata e multivariabile.

Risultati e discussioni: Sono stati analizzati tutti i non sopravvissuti (n = 100) e 100 sopravvissuti (su 1.018). Il genere maschile (67,4%) era il fattore di rischio indipendente per l’infezione da COVID-19. Il gruppo di età avanzata, il diabete, le comorbilità cardiovascolari, neurologiche e ipertensive erano statisticamente associate alla mortalità. L’arresto cardiaco e il danno renale acuto (AKI) sono state le complicanze più comuni. La mortalità è significativamente associata alla linfopenia e all’aumento della lattato deidrogenasi (LDH), come dimostrato da probabilità più elevate.

Inoltre, anche i neutrofili, i monociti, l’aspartato aminotransferasi (AST), la creatinina sierica, l’interleuchina 6 (IL-6) e la proteina C-reattiva (CRP) sono significativamente associati alla mortalità. Le cause più comuni di morte sono state l’insufficienza respiratoria (84%) e la sindrome da distress respiratorio acuto (77%). Dei non sopravvissuti, il 92% ha ricevuto corticosteroidi, il 63% ha ricevuto ossigenoterapia con cannula nasale ad alto flusso, il 29% ha ricevuto ventilazione meccanica e il 29% ha ricevuto tocilizumab.

Conclusione: Il monitoraggio seriale di neutrofili, linfociti, D-dimero, procalcitonina, AST, LDH, CRP, IL-6, creatinina sierica e albumina potrebbe fornire un metodo affidabile e conveniente metodo per classificare e prevedere la gravità e gli esiti dei pazienti con COVID-19.

Parole chiave: sindrome da distress respiratorio acuto [ards]; caratteristiche cliniche e di laboratorio; comorbilità; malattia da coronavirus (covid-19); predittori di mortalità.

Il virus Cycas necrotic stunt (CNSV) ha una vasta gamma di ospiti e viene rilevato a un ritmo accelerato in tutto il mondo in diverse colture agricole. Una delle specie vegetali colpite è la peonia (Paeonia lactiflora Pall.). Il virus è asintomatico nella maggior parte delle cultivar di peonia, ma sono stati segnalati sintomi in altre. È quindi importante studiare il CNSV e la sua struttura della popolazione per ottenere informazioni sulla sua evoluzione ed epidemiologia.

I risultati di questo studio, oltre all’analisi approfondita della struttura della popolazione virale, includono lo sviluppo di un protocollo di rilevamento RT-PCR multiplex in grado di amplificare tutte le sequenze di isolati CNSV pubblicate; consentendo un rilevamento accurato e affidabile del virus e salvaguardando i suoi host suscettibili e propagati clonalmente.

Le infezioni da virus delle piante causano danni a tutti i tipi di colture e provocano enormi perdite economiche e di resa in tutto il mondo. Numerosi rapporti indicano che molti virus delle piante vengono trasmessi verticalmente attraverso i semi e causano gravi sintomi di malattia sulle piantine che fungono di nuovo da fonti di trasmissione secondarie nei campi. Pertanto, è necessario sviluppare metodi efficienti per rilevare i semi infettati da virus. Qui, descriviamo un protocollo RT-PCR per il rilevamento del virus del mosaico delle chiazze verdi di cetriolo (CGMMV), un tobamovirus nei semi delle colture cucurbitacee. Questo metodo può essere facilmente adattato per la diagnosi di altri virus delle piante come il virus della frutta rugosa marrone del pomodoro nei semi.