Studio quantitativo di Golgi della morfologia dendritica nei neuroni spinosi medi dello striato di topo.

• In questo studio, abbiamo fornito un’analisi morfologica quantitativa dettagliata dei neuroni spinosi medi (MSN) nello striato dorsale dei topi e determinato l’accordo di valori tra i tre gruppi di animali ottenuti in diversi set di esperimenti. Gli alberi dendritici di 162 apparati Golgi Cox (  FD   Rapid   GolgiStain   Kit  ) impregnati con MSN da 15 topi adulti C57BL / 6 sono stati ricostruiti tridimensionalmente con il software Neurolucida e i parametri della morfologia dendritica sono stati confrontati tra i gruppi sperimentali.
• I parametri della lunghezza della ramificazione e del modello di ramificazione non hanno mostrato differenze statisticamente significative ed erano altamente coerenti tra i gruppi. L’area media del soma neuronale variava da 160 μm2 a 180 μm2 e le cellule avevano 5-6 dendriti primari  con quasi 40 segmenti per neurone. L’analisi di Sholl ha confermato la regolarità dei rami dendritici.
• La lunghezza totale dei dendriti era di circa 2100 µm, con una lunghezza media dei rami individuali (intermedi) di circa 22 µm e degli arti finali di circa 100 µm.
•  Sebbene ogni gruppo sperimentale abbia seguito lo stesso rigoroso protocollo per la preparazione dei tessuti e la colorazione del Golgi, abbiamo riscontrato un’incoerenza nel volume del dendrite e nella superficie del soma.
• Tali modifiche avrebbero potuto essere influenzate metodologicamente durante la procedura del Golgi, pur senza intaccare la lunghezza dei dendriti e la complessità dell’albero.
• Poiché l’attività neuronale influenza lo spessore dei dendriti, non si può escludere che l’incoerenza di volume osservata fosse correlata agli stati funzionali dei neuroni prima del sacrificio degli animali.
• Le analisi complete della complessità degli alberi e delle lunghezze dei dendriti fornite qui possono servire come strumento aggiuntivo per comprendere la variabilità morfologica nella popolazione più abbondante di neuroni striatali.
• Come parametri di riferimento, possono costituire la base per il confronto con i risultati ottenuti in studi che utilizzano diversi modelli di topi geneticamente modificati per spiegare le diverse condizioni patologiche in cui sono presenti MSN.

Metodo Golgi-Cox modificato e altamente sensibile per l’impregnazione completa e stabile dei neuroni embrionali.

Misurazione con sonda fluorescente del pH intrasosomiale in cellule viventi e del disturbo del pH dovuto a vari fattori.

1. Viene descritto un metodo quantitativo per misurare il pH intrasosomiale nelle cellule viventi. Il destrano marcato con isotiocianato di fluoresceina (  FD  ) viene endocitosi e accumulato nei lisosomi, dove rimane senza apparente degradazione. Lo spettro di fluorescenza di questo composto cambia con il pH nell’intervallo 4-7 e non è seriamente influenzato  dalla concentrazione di FD   , dalla forza ionica o dalla concentrazione di proteine.
2. Le cellule vitali sui vetrini coprioggetto sono poste in una cella spettrofluorimetrica e possono essere perfuse con vari mezzi. Il pH normale all’interno dei lisosomi dei macrofagi sembra essere 4,7-4,8, sebbene possa scendere temporaneamente a 4,5.
3. L’esposizione delle cellule a varie basi deboli e ionofori acidi di potassio provoca un aumento del pH.
4. Le variazioni del pH sono molto   più veloci  dell’accumulo intralisosomiale di basi deboli. Gli inibitori della glicolisi (2-deossiglucosio) e della fosforilazione ossidativa (cianuro o azide) aggiunti insieme, ma non separatamente, aumentano il pH intralisosomiale. Questi risultati forniscono prove di un meccanismo di accumulo di protoni attivo nella membrana lisosomiale e supportano la teoria dell’accumulo di basi deboli nei lisosomi mediante intrappolamento di protoni.

Colorazione Golgi-Cox di dendriti neuronali e spine dendritiche con il kit FD Rapid GolgiStain.

Il metodo Golgi-Cox è una delle tecniche più efficaci per lo studio della morfologia dei dendriti neuronali e delle spine dendritiche. Tuttavia, l’affidabilità e il lungo processo di colorazione di Golgi-Cox sono stati i principali ostacoli all’uso diffuso di questa tecnica.

Per superare  queste carenze e promuovere questa preziosa tecnica, abbiamo sviluppato il  kit FD   Rapid   GolgiStain    basato sul principio dei metodi descritti da Ramón-Moliner nel 1970 e Glaser e Van der Loos nel 1981. Il   kit   migliora e semplifica notevolmente il Golgi-Cox Tecnica.

Questo   kit  è affidabile per visualizzare i dettagli morfologici dei neuroni, consentendo l’analisi di vari parametri della morfologia dendritica, come la lunghezza e il modello dei rami dendritici e il numero, la forma e la dimensione delle spine dendritiche, sia nel cervello animale che dopo quello umano Morte. È disponibile un video tutorial di 40 minuti sul congelamento, la criosezione e la colorazione dei tessuti.

Sviluppo di un protocollo ottimizzato per il metodo di microscopia elettronica di Golgi basato sulla procedura di colorazione di Golgi-Cox utilizzando un   kit commerciale  .

• L’introduzione del   kit FD   Rapid   GolgiStain ha    permesso a molti ricercatori di studiare facilmente la morfologia dei neuroni.
• Grazie al metodo di impregnazione Golgi-Cox migliorato,   con questo kit  è possibile ottenere immagini colorate di neuroni stabili e altamente sensibili .
• Per analizzare  in dettaglio microstrutture come spine dendritiche e coni di crescita, abbiamo cercato di creare un metodo utile che combina la colorazione di Golgi-Cox e la microscopia elettronica (metodo Golgi-EM) in modo che i  campioni colorati del kit preparati  siano adatti per l’uso in microscopia elettronica ( EM) ricerca.
• I risultati di questo studio suggeriscono l’importanza della fase di legame della glutaraldeide nel metodo Golgi-EM.
• Qui presentiamo il protocollo consigliato per il metodo Golgi-EM che è disponibile per la microscopia elettronica ad altissima tensione e la microscopia elettronica a trasmissione.
• Siamo convinti che il nostro metodo Golgi-EM potrebbe diventare un metodo affidabile e valido che potrebbe contribuire a nuove scoperte nella morfologia neuronale.
• Colorazione della glia coerente e riproducibile con il metodo Golgi-Cox modificato.

La colorazione di Golgi-Cox è un potente approccio istochimico ampiamente utilizzato per visualizzare la morfologia dei neuroni e della glia.